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PCR实验室的建立方法 pcr实验步骤

PCR实验室的建立方法

1、建立样品准备区这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。3、建立前PCR区。该去专门用于准备各种反应,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。4、PCR实验室试剂的操作。⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。5、在前PCR区建立PCR混合物。⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。6、控制污染的方法。已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线,这种方法不能完全消除污染问题,但可以将污染降低几个数量级。7、后PCR区PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动

pcr实验步骤

PCR实验室污染了怎么处理?

A. 实验室进行通风处理,至少2 周的时间;

通风可加速扩增产物的消散的速度

B. 使用清水对实验台面、实验室进行清洗;

DNA不溶于酒精,使用清水多次擦拭后可消除附在实验台面等的核酸DNA;

C. 使用紫外灯进行房间的照射;

紫外线及产生的臭氧都有破坏DNA结构的作用

D. 之前使用的灭菌锅使用清水清洗多次,不要和耗材等在一起灭菌;

E. 可用1mol/L 的盐酸对可疑器具或者实验台面进行浸泡或擦拭。

盐酸可使DNA脱嘌呤,破坏DNA的结构。

F. 若有条件,选择一个新的实验环境进行检测实验最好。

有谁做过细菌的PCR实验吗

首先你要提出细菌的DNA。

方法如下:

1、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡(转速160r/min)培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中,再加甘油(30-40%)进行保种。(-80摄氏度保藏2年)

2、提取DNA(CTAB法):

(1)取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。

(2)向沉淀物中加入350ul双蒸水,重新悬浮沉淀。

(3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),溶菌酶3ul,混匀,于50℃温育1h。

(4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混匀,再加入50ul CTAB/NaCl溶液,混合后再65℃温育30min。

(6)冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质):氯仿:异戊醇(增强酚的作用)(25:24:1),小心上下颠倒混匀,12000r/min离心5min,将上清液转移到新的EP管,重复此步骤2-3次,直至分层界面无白色沉淀。

(7)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒混匀,12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。(纯化作用)

(8)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,12000r/min离心15min弃上清。

(9)向离心管中加入75%乙醇,12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀,小心弃上清,重复洗涤1次,弃上清将离心管倒置于吸水纸上,晾干。

(10)加入50ul(双蒸水)/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。

(11)电泳检测

6、PCR扩增:(细菌的通用引物为27F和1492R)将提取得到的DNA进行PCR扩增,电泳检测扩增得到的16S rDNA(如果菌类分明,条带清晰,PCR原液可直接送去测序,双向测通,得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对,得出鉴定结果)

7、酶切带型分型确定操作单元:将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切,电泳检测酶切产物,酶切带型相同的分为一个操作单元。

8、连接转化:从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中,将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上,倒置培养12-16h。

9、克隆子挑选及PCR鉴定:从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h,以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定(1000-2000bp)。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。

10、测序:将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。

11、序列拼接:运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。

12、建树:对拼接得到的序列用Blast进行比对,最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。

pcr实验室面积是否有严格要求

关于建设PCR实验室的基本设备与要求

摘要:为规范临床基因扩增检验实验室管理,保证临床基因扩增检验质量,使临床诊断和治疗更为科学、合理,特制定本办法。

关键词:PCR 实验室

临床基因扩增检验实验室管理暂行办法

第一章 总 则

第一条 为规范临床基因扩增检验实验室管理,保证临床基因扩增检验质量,使临床诊断和治疗更为科学、合理,特制定本办法。

第二条 临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的,以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术,如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的放大系统(TAS)自主序列复制系统(3SR)和链替代扩增(SDA)等。

第三条 本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。

第四条 临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。

第五条 卫生部临床检验中心(以下简称卫生部临检中心)和省、自治区、直辖市临床检验中心(以下简称省临检中心)负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。

第二章 实验室设置和验收

第六条 拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(见附件)筹建实验室;筹建完成后,由法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料:

(一)《医疗机构执业许可证》复印件;

(二)可行性研究报告;

1、 拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运行的预测分析;

2、 拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图;

3、 拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有关技术人员资料

第七条 卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组(以下简称专家组),按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后,在20日内将验收报告寄送至申请机构。

第八条 经专家组技术验收合格的医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送至省级行政部备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门后15日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见,方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。

第九条 未经专家组验收合格并报省级卫生行政部门备案的医疗机构不得擅自开展临床基因扩增检验项目。

第三章 实验室监督管理

第十条 临床基因检验实验室必须按照《临床基因扩增检验实验室工作规范》(另发)开展临床基因扩增检验工作。

第十一条 临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。经培训合格者,由培训单位发给合格证书,并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。

培训单位为卫生部临检中心,或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临检中心认定的机构。培训时使用规定的统一教材。

第十二条 以科研为目的的基因扩增检验项目。不得向临床出具检验报告,不得向病人收取任何费用。

第十三条 临床基因扩增检验实验室必须按照《临床基因扩增实验室工作规范》开展室内质量控制,并参加卫生部临检中心组织的室内质量评价。

第十四条 卫生部临检中心按照本方法和《临床基因扩增实验室工作规范》协调、组织省临检中心对临床基因扩增检验实验......

rt pcr试验前需做哪些准备

要准备好内参引物,目的基因引物,和反转录好的模板,其他的就按普通PCR扩增就可以了。

PCR扩增实验中加样顺序是怎样的,为什么要按这种顺序加啊

一般加东西按照从大体积加到小体积的顺序,这样加样准。小体积的东西容易沾在枪头上,所以最好再溶液或中轻轻吹一下。水的体积一般最大,最先加。酶容易变性,要在冰盒中操作,最后加。其他的顺序随便。

逆转录PCR的实验步骤用到哪些试剂和仪器

一、实验器具与材料:

1、移液器:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸头:1ml、200μl、20μl

3、匀浆管:5ml

4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖);1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)

7、量筒:50ml、250ml、500ml

8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml

9、试管架:5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

11、铝制饭盒:4个

12、塑料小饭盒:1个13、大瓷缸:2个

14、锡泊纸:一卷

15、卷纸:2卷

16、三角烧瓶:带盖,稍大

二、实验器具的处理与准备

1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)

2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)

3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)

三、试剂配制:

1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)

3、异丙醇:放入棕色瓶中

4、氯仿:放入棕色瓶中

5、琼脂糖

仅供参考

在生物实验中PCR的具体步骤是什么?

体系是:PCR buffer,Taq酶,dNTPs,引物,模板,ddH2O补充至20ul或50ul体系。

举例:10 × buffer: 2 ul

dNTP(2.5mmol): 2ul

引物(2.5umol): 1.5ul

模板: 1ul

Taq: 偿 0.2ul

ddH2O: 13.3ul

程序:1 94度 5min

2 94度 1min

3 55度 1min

4 72度 2min(1min 1000bp)

2-4重复35个循环

5 72度 10min

6 4度 hold

pcr实验过程中阈值线怎么调 两个不同的反应液

PCR产物的电泳检测时间   一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失.

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究.

酶切分析:

根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究.   分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法.   Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研.   斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析.   氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.

温度与时间的设置:   基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).

实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一.因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:

1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;

2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;

3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底.若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;

5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;

6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;

7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器.如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;

8. 重复实验,验证结果,慎下结论.

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